基本原理

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

一、蛋白样品制备流程

单层贴壁细胞总蛋白的提取

1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。　　

2.每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3.按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM)，摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)

4.每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)　　

6.于4℃下12000 rpm离心5 min。(提前开离心机预冷)　　

7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。

注意事项：

蛋白质的样品制备是Western Blot的第一步，WB待测组织净重与裂解液的体积比例为1g:10ML。同时，要想获得所有蛋白质，还应注意以下问题：

（1）在合适的条件下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

（2）选择合适的表面活性剂和还原剂，使其形成各自多肽的溶液。

（3）尽量去除核酸、多糖、脂类等分子的干扰，裂解完毕离心之后取中层澄清溶液时避免吸到底层沉淀和上层脂类。

（4）整个制作蛋白样本的制备过程必须在低温下进行，避免细胞破碎释放出各种酶类，但是注意不要反复冻融哦。

二、SDS-PAGE电泳　

清洗玻璃板，一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

灌胶与上样

1.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。)　　

2.配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。)　　

3.分离胶凝固大约30min~40min左右，当水和胶之间有一条折射线时，说明分离胶已凝了。再等3min使分离胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4.配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使浓缩胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于浓缩胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。浓缩胶凝固大约40min~60min左右，浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。　　

5.用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)　　

6.测完蛋白含量后，计算含20~50ug蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5 ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的大限度可加20 μl样品。)上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。

7.加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

注意事项：

制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10%AP和TEMED至开始凝胶，时间为10~20分钟(未完全凝聚)，浓缩胶最佳聚合时间为8~10 min，可通过控制AP和TEMED量来控制。

分子量与分离胶浓度参考：分子量 4-40 kDa，分离胶浓度 20%；分子量12-45 kDd，分离胶浓度 15%；分子量 10-70 kDa，分离胶浓度 12.5%；分子量 15-100 kDa，分离胶浓度 10%；分子量 25-200 kDa，分离胶浓度 8%。

电泳

电泳时间一般1~1.5h，电压为150V较好，也可用200V，可以根据不同仪器的建议电压来进行调整。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。　

注意事项：

（1）应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀，否则条带容易中间凹陷两边翘起。

（2）两板玻璃之间排除所有的气泡，防止条带中间鼓两边下陷。

（3）加样前离心，选择适当的样本缓冲液，加适量的样品促溶剂，防止wb条带拖尾或蛋白出现纹理。

三、转膜

PVDF膜

1.准备：切好的PVDF膜置于甲醇30s左右激活，PVDF膜和滤纸置于电转缓冲液浸泡10min以上，转一张膜需6张6cm×9cm滤纸和1张6cm×9cmPVDF膜，滤纸和膜的尺寸不能小于胶的尺寸，否则导致电流不能通过膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因手上的蛋白会污染膜。

2.加有转膜液搪瓷盘中放入转膜用的已浸过的PVDF膜和滤纸。

3.电泳结束后撬掉玻璃板取胶，除去小玻璃板，轻轻刮去浓缩胶。

4.小心剥下分离胶盖于已泡好的滤纸上。

5.转膜遵循的原则是电压尽量小而电流尽量大，时间一般为1h，根据电压和电流的不同也会存在差异，转膜时间要严格控制，否则PVDF膜容易烧焦。另外，转膜过程需在冰水浴中进行。

6.转完后将滤纸扔掉，PVDF膜右上角用剪子切断一小部分进行标记，Marker用红蓝铅笔进行标记。

7.PVDF膜放入PBS-T溶液，振荡5min×3次。

注意事项

（1） 避免直接接触膜，全程戴手套并使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑；

（2） PVDF膜具有疏水性，使用之前需用甲醇浸泡；NC膜则不需要甲醇激活，可以根据自己的实验需求来选择膜的种类。

（3） 排列三明治时，尽量用干净的玻璃棒或试管赶走胶和膜之间的气泡，避免转膜不均匀；

（4） 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否则会导致电流不能通过膜，从而转膜无效。

四、封闭与杂交

封闭

1.蛋白质免疫印迹电泳转膜过后，为防止与一抗或二抗非特异性结合，膜上其他没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭。

2.封闭液中加入适量的防腐剂，避免封闭蛋白变性影响封闭效果。

封闭液的选用要求：

(1)常用封闭液为脱脂牛奶、牛血清白蛋白、无蛋白封闭液等。

(2) 封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时。

(3) 封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7。

注意事项：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换。

抗体杂交

（1）适当降低抗体的浓度，增加洗膜次数防止非特异性条带过多；

（2）优化转移时间和电流，增加抗体的浓度，适当延长曝光时间，防止信号弱、可能转膜不完全；

（3）一抗尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白；

（4）二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。

注意事项：

（1）建议使用新鲜抗体，不建议抗体重复利用。

（2）抗体孵育时，膜尽量不要裁剪。

（3）抗体孵育后充分洗涤，去除非特异性结合。

五、显色

将 A、B 发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于 A、B 混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min 左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

六、实验过程中的一些常见问题及解决方案

（1）信号强度低

信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：

①样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；

②蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF 的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；

③转膜不充分：可以使用丽春红S染膜或使用考马斯亮蓝染胶检测转膜效果；检查转膜操作是否正确；可以使用两张膜叠加载一起，防止转膜过度。

④抗体染色不充分：增加抗体浓度；延长孵育时间；

⑤曝光时间过短：增加曝光时间即可。

⑥缓冲液相关：可能含有HRP抑制剂，应避免叠氮钠和HRP一起使用。

⑦抗体和抗原。可能是抗体浓度过低、抗体和抗原亲和力较低或抗体活性较低等原因，通过提高抗体浓度、选择有效期内的抗体可避免。可能存在问题是抗原量不足，应检查待测样本，增加上样量。

⑧蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl 浓度等；

⑨抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间；

⑩甲醇浓度过高。会招致蛋白质与 SDS 别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。

（2）非特异性条带或条带位置不对

WB 结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。普通来说惹起这类问题的主要要素有：

① 抗体的非特异性分离。通常以为，多抗的特异性不如单抗，更容易产生非特异性条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异性分离的可能，倡议设二抗阴性对照；

② 样品蛋白量过高。恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与封锁时间可防止蛋白量过高对实验结果的不良影响；

③ 蛋白质降解。会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品；

④ 细胞传代次数过多。会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株；

⑤ 蛋白存在复合物。有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物；

⑥ 蛋白存在剪接体或多种修饰方式。局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活性，在 WB 中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot 来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。

（3）背景过高——均一性高背景

在局部 WB 结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观。这种问题的可能缘由有以下几点：

①抗体相关。

一抗、二抗浓度较高，应选择最适宜的抗体稀释度，优化稀释条件；或者一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。抗体储存时间较长或储存条件不佳导致抗体失活：宜选择新的抗体。

②实验操作相关

检测时曝光时间过长，可减少曝光时间；

膜封闭不够，宜优化封闭的时间和温度、选择合适的封闭液；

膜的选择有问题：实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜；

孵育中洗膜不充分：适当增加洗膜时间和次数；确保在充分震荡的条件下孵育膜，并且抗体充分覆盖膜表面。

③缓冲液相关

缓冲液中去污剂不足，应增加TBST中Tween 20的浓度；

转膜液、封闭液等不新鲜或被污染，宜现配现用。

背景过高——斑点或闪烁式的非均一性高背景

①抗体相关

二抗聚集：使用前过滤二抗或更换二抗；

封闭剂中有聚集体：使用前过滤封闭剂或者更换。

②缓冲液相关

仪器污染：使用前应确保所有仪器和用具洁净，确保膜上无残留胶。

（4）条带弥散或外形怪异

有时 WB 结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下：

①微笑条带：电泳系统温度偏高，而且电场强度太大（电泳的电场大致呈现U形）时容易出现。应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（考虑加入适合的蛋白酶抑制剂）。

②皱眉条带：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。可通过调整装置来避免该问题。

③条带拖尾：样品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。

④部分条带变形：可能原因是SDS-PAGE胶中有气泡或者不溶性颗粒。

⑤哑铃状不均匀条带：一是由于配置胶有问题，胶凝固后不均一，可通过重新配置胶，确保胶质量无问题来避免该现象出现；二是样品可能含有过多杂质，在样品使用前离心可有效避免。

⑥条带粘连：可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。可通过减少上样量和提高配胶质量来避免。

⑦纵向条纹（纹理条带）：样品中含有不溶性颗粒，可能抽提蛋白时出了问题。

（5）膜上分布不平均的污点

有时在 WB 做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点：

① 试剂、仪器等污染。倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂；

② 转膜时有气泡。确保在转膜过程中将气泡扫除洁净；

③ 抗体孵育时与膜接触不充沛。确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；

④ 曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；

⑤ 膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。